A Practical Guide to Improving the Accuracy and Reliability of Disk Diffusion
Results
راهنمای عملی برای افزایش دقت و قابلیت اعتماد نتایج روش انتشار دیسک
Introduction
Antimicrobial susceptibility testing (AST) is an essential component of clinical microbiology. Accurate susceptibility results help clinicians select appropriate antimicrobial therapy and contribute to antimicrobial stewardship and infection-control programs. However, the reliability of an antibiogram depends not only on the antimicrobial disks or the identification of the organism, but also on the correct execution of every step of the testing procedure.
Disk diffusion testing is a standardized phenotypic method in which bacterial growth inhibition around antimicrobial disks is measured as a zone diameter and interpreted according to an appropriate breakpoint standard. CLSI M02 provides standardized procedures for disk diffusion testing, while CLSI M100 provides current breakpoint and quality-control tables. EUCAST also provides a standardized disk diffusion methodology and updated breakpoint tables.
مقدمه
تست تعیین حساسیت آنتیمیکروبی (AST) یکی از بخشهای اساسی میکروبشناسی بالینی است. نتایج دقیق آنتیبیوگرام به پزشک در انتخاب درمان ضد میکروبی مناسب کمک کرده و در برنامههای مدیریت مصرف آنتیبیوتیکها و کنترل عفونت نیز اهمیت دارد. با این حال، قابلیت اعتماد نتیجه آنتیبیوگرام تنها به کیفیت دیسک آنتیبیوتیک یا شناسایی صحیح میکروارگانیسم وابسته نیست، بلکه اجرای صحیح تمام مراحل آزمون نیز اهمیت اساسی دارد.
روش انتشار دیسک یک روش فنوتیپی استاندارد است که در آن میزان مهار رشد باکتری در اطراف دیسک آنتیبیوتیکی به صورت قطر هاله عدم رشد اندازهگیری و سپس بر اساس استاندارد و Breakpoint مناسب (مثلا جداول CLSI) تفسیر میشود. استاندارد CLSI M02 روش انجام آزمون انتشار دیسک را استاندارد میکند و CLSI M100 جداول بهروز Breakpoint و روش های کنترل کیفی را ارائه میدهد. EUCAST نیز روش استاندارد انتشار دیسک و جداول تفسیری (breakpoint tables) بهروز مربوط به خود را منتشر میکند. بر اساس این دو استاندارد (CLSI و EUCAST ) مهمترین منابع ایجاد خطا در هنگام آنتی بیوگرام موارد زیر می باشند.
1. Incorrect Inoculum Density
One of the most important variables in disk diffusion testing is the density of the bacterial inoculum. An inoculum that is too heavy or too light can alter the observed inhibition zones and consequently affect the interpretation of susceptibility.
For standardized disk diffusion testing, the inoculum is commonly prepared to an approximately 0.5 McFarland turbidity, where appropriate for the organism and method. The standardized inoculum should be used promptly according to the applicable method.
۱. تراکم نامناسب سوسپانسیون باکتریایی
یکی از مهمترین عوامل مؤثر بر نتیجه آنتیبیوگرام، تراکم سوسپانسیون باکتریایی است. سوسپانسیون باکتریایی بیش از حد غلیظ یا رقیق میتواند قطر هالههای عدم رشد را تغییر داده و در نتیجه بر تفسیر حساسیت نسبت به آنتی بیوتیک تأثیر بگذارد.
در روش استاندارد انتشار دیسک (کربی – بائر)، معمولاً سوسپانسیون باکتریایی معادل کدورت 0.5 مکفارلند تهیه میشود. سوسپانسیون استانداردشده باید مطابق روش مورد استفاده و در زمان مناسب مورد استفاده قرار گیرد.
Common consequence
A heavy inoculum may produce smaller inhibition zones, while an insufficient inoculum may produce artificially larger zones.
پیامد احتمالی
تراکم بیش از حد باکتری میتواند باعث کوچکتر شدن هاله عدم رشد و تراکم کمتر از حد میتواند باعث بزرگتر شدن غیرواقعی هاله عدم رشد شود.
Best practice
Standardize the inoculum and use an appropriate validated procedure for turbidity assessment.
راهکار
سوسپانسیون باکتریایی را به صورت استاندارد تهیه کرده و برای ارزیابی کدورت از روش معتبر و مناسب استفاده کنید.
2. Poor-Quality or Inappropriate Mueller-Hinton Agar
Mueller-Hinton agar (MHA) is a critical component of routine disk diffusion testing. The quality and preparation of the medium can influence antimicrobial diffusion and bacterial growth. Important characteristics include appropriate composition, pH, depth, and storage conditions.CLSI and EUCAST emphasize the importance of standardized media for reliable susceptibility testing. EUCAST also provides specific requirements for media preparation and quality control.
۲. استفاده از محیط مولر هینتون نامناسب یا با کیفیت نامطلوب
محیط مولر هینتون آگار (MHA) یکی از اجزای اساسی در انجام آنتی بیوگرام به روش انتشار دیسک است. کیفیت و نحوه آمادهسازی محیط میتواند بر انتشار آنتیبیوتیک و رشد باکتری تأثیر بگذارد. عواملی مانند اجزای مناسب تشکیل دهنده محیط، pH، ضخامت و شرایط نگهداری محیط اهمیت زیادی دارند.
CLSI و EUCAST بر استفاده از محیط استاندارد و کنترلشده برای دستیابی به نتایج قابل اعتماد تأکید دارند.
EUCAST همچنین الزامات اساسی جهت تولید ، آمادهسازی و کنترل کیفی محیطهای مورد استفاده در تست آنتی بیوگرام ارائه کرده است.
Key point
For routine disk diffusion testing, the laboratory should use a validated Mueller-Hinton agar source and maintain appropriate quality-control procedures.
نکته کلیدی
برای انجام آنتیبیوگرام روتین، آزمایشگاه باید مولر هینتون آگار را از منبع معتبر و اعتبارسنجیشده تهیه نماید و در هنگام استفاده کنترل کیفی مناسب محیط را انجام دهد.
3. Incorrect Agar Depth
Agar depth can influence antimicrobial diffusion and therefore affect inhibition-zone diameters. Excessively thick or thin agar can produce systematic changes in zone sizes.
For standard disk diffusion testing, the applicable reference method should be followed for plate preparation and agar depth rather than relying on visual estimation alone.
۳. ضخامت نامناسب محیط
ضخامت محیط آگار میتواند بر انتشار آنتیبیوتیک و در نتیجه بر قطر هالههای عدم رشد تأثیر بگذارد. محیط بیش از حد ضخیم یا نازک ممکن است باعث ایجاد تغییرات سیستماتیک در قطر هالهها شود.
در روش استاندارد انتشار دیسک، آمادهسازی پلیت و ضخامت محیط باید مطابق روش مرجع مورد استفاده انجام شود و نباید تنها بر تخمین چشمی تکیه کرد. در روشهای استاندارد دیسک دیفیوژن، ضخامت اسمی 4 میلیمتر به عنوان معیار رایج استفاده میشود و کنترل واقعی ضخامت اهمیت دارد.
4. Incorrect Timing of Disk Application
After inoculation, excessive delay before application of antimicrobial disks may allow bacterial growth to begin before the antimicrobial gradient is established. This can affect the resulting inhibition zones.
The disk should therefore be applied within the time window specified by the selected standard or validated laboratory procedure.
۴. تأخیر نامناسب در قرار دادن دیسکها
پس از تلقیح محیط، تأخیر بیش از حد در قرار دادن دیسکهای آنتیبیوتیکی ممکن است باعث شروع رشد باکتری پیش از شکلگیری مناسب گرادیان آنتیبیوتیک شود و در نتیجه قطر هالههای عدم رشد را تحت تأثیر قرار دهد.
بنابراین دیسکها باید در بازه زمانی تعیینشده توسط استاندارد انتخابی یا روش اعتبارسنجیشده آزمایشگاه روی محیط قرار گیرند.
5. Incorrect Disk Storage
Antimicrobial disks contain defined amounts of active antimicrobial agents. Exposure to inappropriate temperature, humidity, or repeated handling outside the manufacturer’s specified conditions may compromise disk performance.
Storage and handling conditions should always follow the disk manufacturer’s instructions and the applicable AST standard.
۵. نگهداری نامناسب دیسکهای آنتیبیوتیکی
دیسکهای آنتیبیوتیکی حاوی مقدار مشخصی از ماده فعال ضد میکروبی هستند. قرار گرفتن دیسکها در دمای نامناسب، رطوبت یا شرایط نگهداری خارج از دستورالعمل سازنده میتواند عملکرد آنها را تحت تأثیر قرار دهد.
شرایط نگهداری و استفاده از دیسکها باید همواره مطابق دستورالعمل شرکت سازنده و استاندارد AST مورد استفاده باشد. EUCAST نیز بر اهمیت نگهداری و کنترل کیفیت دیسکها تأکید دارد.
6. Incorrect Disk Placement and Spacing
Antimicrobial disks should be positioned so that inhibition zones can develop without inappropriate overlap. Disks placed too close together may produce overlapping or distorted zones and make interpretation difficult.
۶. فاصله و جایگذاری نامناسب دیسکها
دیسکهای آنتیبیوتیکی باید به گونهای روی محیط قرار گیرند که هالههای عدم رشد بدون تداخل نامناسب آنتی بیوتیک ها با یکدیگر تشکیل شوند. قرار دادن دیسکها در فاصله بسیار کم میتواند باعث همپوشانی یا تغییر شکل هالهها شده و تفسیر نتیجه را دشوار کند.
Best practice
Follow the disk-placement requirements of the selected standard and ensure sufficient separation for accurate zone reading.
راهکار
لزامات استاندارد انتخابشده برای جایگذاری دیسکها بر روی محیط مولر هینتون آگار را رعایت نموده و فاصله کافی برای قرائت صحیح هالهها را در نظر بگیرید.
7. Incorrect Incubation Conditions
Incubation temperature, atmosphere, duration, and other organism-specific conditions can influence bacterial growth and susceptibility results. The correct incubation conditions depend on the organism and the selected standard.
Therefore, laboratories should not use a single incubation condition for every organism. The applicable CLSI or EUCAST method and breakpoint table should always be consulted.
۷. شرایط نامناسب انکوباسیون
دمای انکوباسیون، اتمسفر، مدت زمان انکوباسیون و سایر شرایط اختصاصی میتوانند بر رشد باکتری و نتایج حساسیت آنتیبیوتیکی تأثیر بگذارند. شرایط مناسب انکوباسیون به نوع میکروارگانیسم و استاندارد مورد استفاده بستگی دارد. لذا نباید شرایط انکوباسیون یکسان برای تمام میکروارگانیسمها در نظر گرفته شود. به این منظور جداول مربوطه ، روش ها و Breakpoint های مرتبط با شرایط مناسب انکوباسیون موجود در آخرین نسخه های استاندارد CLSI یا EUCAST باید بررسی و مورد مراجعه و توجه قرار گیرند.
8. Incorrect Reading of Inhibition Zones
Accurate measurement of inhibition zones is essential for reliable interpretation. The zone should be read according to the reading rules specified by the selected standard. Ambiguous growth patterns, colonies within zones, swarming, or unusual edges may require specific interpretation rules.
A common mistake is to measure the zone inconsistently or to apply a personal interpretation rather than the standardized reading criteria.
۸. قرائت نادرست هالههای عدم رشد
اندازهگیری دقیق هالههای عدم رشد برای تفسیر صحیح نتایج ضروری است. هاله باید مطابق قواعد قرائت تعیینشده در دستورالعمل های استاندارد مورد استفاده (CLSI) اندازهگیری شوند. الگوهای رشد غیرمعمول، وجود کلنی در داخل هاله، سوارمینگ و یا لبههای نامشخص هاله ممکن است نیازمند قواعد تفسیری اختصاصی باشندکه در استانداردهای مربوطه به تفصیل شرح داده شده است. یکی از خطاهای رایج در آنتی بیوگرام، اندازهگیری هاله عدم رشد به روشهای متفاوت و یا با تکیه بر برداشت شخصی به جای استفاده از معیارهای استاندارد می باشد.
9. Using Outdated Breakpoints
Even when the laboratory procedure has been performed correctly, interpretation can become incorrect if outdated breakpoint tables are used. Breakpoints may be revised as new clinical, pharmacokinetic, epidemiological, and microbiological evidence becomes available.
Laboratories should use the current edition of their selected standard and ensure that staff are aware of changes in breakpoint tables and terminology. CLSI M100 36th Edition was published in January 2026, while EUCAST provides updated breakpoint tables as part of its annual methodology and interpretation framework.
۹. استفاده ازجداول و Breakpointهای قدیمی استانداردها
حتی اگر تمام مراحل آزمایش به درستی انجام شده باشد، استفاده از Breakpoint های قدیمی در جداول استانداردهای CLSL و EUCAST میتواند باعث تفسیر نادرست نتیجه شود. عموما Breakpointها مندرج در جداول ذتوسط موسسه های استاندارد ممکن است بر اساس شواهد جدید بالینی، فارماکوکینتیکی، اپیدمیولوژیک و میکروبیولوژیک بهروزرسانی شوند. آزمایشگاه باید از آخرین ویرایش استاندارد انتخابی مورد نظر خود استفاده نموده و کارکنان خود را نسبت تغییرات Breakpointها ، اصطلاحات و تفسیرهای جدید مطلع نگه دارد. ویرایش 36 استاندارد CLSI M100 در ژانویه 2026 منتشر شده است و EUCAST نیز جداول Breakpoint خود را به صورت دورهای بهروزرسانی میکند.
10. Neglecting Quality Control
Quality control is an integral part of antimicrobial susceptibility testing. Appropriate reference strains are tested to verify that the test system is performing within expected limits. If QC results fall outside the acceptable range, patient results should not simply be accepted without investigating the cause. Potential sources include the medium, antimicrobial disks, inoculum, incubation conditions, equipment, or technique.
CLSI M100 provides QC parameters associated with standardized AST procedures, while EUCAST publishes specific QC recommendations for disk diffusion and MIC testing.
۱۰. بیتوجهی به کنترل کیفی
کنترل کیفی بخش جداییناپذیر تعیین حساسیت آنتیمیکروبی است. در این فرآیند از سویههای مرجع مناسب برای بررسی عملکرد سیستم آزمون و اطمینان از قرار داشتن نتایج در محدوده قابل قبول استفاده میشود.
اگر نتیجه کنترل کیفی خارج از محدوده قابل قبول باشد، نباید بدون بررسی علت، نتایج بیماران را پذیرفت. منابع احتمالی خطا میتوانند شامل محیط کشت مورد استفاده، دیسک آنتیبیوتیک، سوسپانسیون باکتریایی، شرایط انکوباسیون، تجهیزات مورد استفاده و یا تکنیک انجام آزمون باشند.
CLSI M100 پارامترهای کنترل کیفی مرتبط با روشهای استاندارد AST را ارائه میدهد و EUCAST نیز توصیههای اختصاصی QC برای دیسک دیفیوژن و تعیین MIC منتشر میکند.
A Practical Quality Checklist
Before accepting an antimicrobial susceptibility test result, verify:
- Correct organism identification and pure culture
- Appropriate inoculum preparation
- Standardized inoculum density
- Appropriate Mueller-Hinton agar
- Correct media quality and preparation
- Appropriate antimicrobial disks
- Correct disk storage and handling
- Correct disk placement and spacing
- Appropriate incubation conditions
- Accurate zone measurement
- Current breakpoint tables
- Acceptable quality-control results
پیش از تأیید نتیجه آنتیبیوگرام، موارد زیر را بررسی نموده و از مناسب بودن آن اطمینان حاصل کنید:
- شناسایی صحیح میکروارگانیسم و خالص بودن و تازه بودن کشت مورد استفاده
- تهیه صحیح سوسپانسیون باکتریایی (معمولا بر اساس نیم مکفارلند)
- استاندارد بودن تراکم میکرو ارگانیسم و حجم نمونه تلقیح
- استفاده از محیط کشت مولر هینتون آگار مناسب
- کنترل کیفیت و آماده سازی صحیح محیط کشت
- استفاده از دیسک آنتیبیوتیکی مناسب
- اطمینان از روش نگهداری و نقل و انتقال صحیح دیسکها
- جایگذاری و فاصلهگذاری صحیح دیسکها بر روی محیط
- اطمینان از شرایط مناسب انکوباسیون
- اندازهگیری صحیح قطر هاله عدم رشد
- استفاده از آخرین جداول Breakpoint ها در آخرین ورژن استانداد مورد استفاده
- اطمینان از قابل قبول بودن نتایج کنترل کیفی در تمام مراحل کار
Conclusion
Reliable antimicrobial susceptibility testing is not the result of a single step; it is the outcome of controlling the entire testing process. Standardized inoculum preparation, appropriate Mueller-Hinton agar, properly stored antimicrobial disks, correct incubation, accurate zone reading, current interpretive criteria, and routine quality control all contribute to the reliability of the final result.
For clinical laboratories, adherence to a current standardized methodology such as CLSI or EUCAST is essential. Laboratory procedures should always be aligned with the selected standard, the organism being tested, the antimicrobial agent, and the manufacturer’s validated instructions where applicable.
جمعبندی
نتیجه قابل اعتماد در تعیین حساسیت آنتیمیکروبی حاصل یک مرحله منفرد نیست، بلکه نتیجه کنترل صحیح تمام مراحل آزمون است. تهیه سوسپانسیون استاندارد، استفاده از مولر هینتون آگار مناسب، نگهداری صحیح دیسکهای آنتیبیوتیکی، انکوباسیون صحیح، قرائت دقیق هالهها، استفاده از استاندارد ها و معیارهای تفسیری بهروز و اجرای منظم کنترل کیفی، همگی در افزایش قابلیت اعتماد نتیجه نهایی نقش دارند.
برای آزمایشگاههای تشخیص پزشکی، پیروی از یک روش استاندارد و بهروز مانند CLSI یا EUCAST ضروری است. روش اجرایی آزمایشگاه باید همواره با استاندارد انتخابشده، نوع میکروارگانیسم، آنتیبیوتیک مورد آزمایش و در موارد لازم دستورالعمل اعتبارسنجیشده شرکت سازنده هماهنگ باشد.
Scientific Note
This article is intended for educational purposes and does not replace the current CLSI or EUCAST standards, organism-specific instructions, or validated laboratory procedures. Breakpoints and testing recommendations can change; laboratories should consult the current version of the standard they have adopted before performing or reporting AST.
یادداشت علمی
این مقاله با هدف آموزش تهیه شده و جایگزین آخرین نسخه استانداردهای CLSI یا EUCAST، دستورالعملهای اختصاصی مربوط به میکروارگانیسمها یا روشهای اعتبارسنجیشده آزمایشگاه نیست . Breakpointها و توصیههای مربوط به انجام آزمون ممکن است تغییر کنند؛ بنابراین آزمایشگاه باید پیش از انجام یا گزارش AST، آخرین نسخه استاندارد مورد استفاده خود را بررسی نماید.
References
CLSI M100 – Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing
CLSI M02 – Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests
EUCAST – Disk Diffusion and Quality Control
Zist Royesh Co. | Comfort in Diagnosis
آسایش در تشخیص با استفاده از محصولات تولیدی شرکت تعاونی دانش بنیان زیست رویش
📞 Shahrekord: 09127215968
📞 Tehran: 09055197726
📞 Isfahan: 09134694535
📞 Factory: 03832281731-35
🌐 www.zistroyesh.com